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病原微生物污染是食品安全领域始终面临的挑战之一，随着耐药菌污染风险的提高和人们对健康食品需求的增长，安全高效、天然无毒的新型抗菌剂——乳酸菌细菌素逐渐成为人们研究的热点。通常根据细菌素的分子质量、热稳定性和翻译后修饰情况进行分类。其中，IIb类细菌素为小型（＜10 kDa）热稳定且无翻译后修饰的细菌素，它们通常包含两条相互作用的肽链，且两条肽链含量大致相同时才能发挥出最佳的抗菌活性。

随着研究的深入，双肽细菌素的结构变化与生理功能间的关系愈发明朗，对其分子层面的机制解析也有助于抗菌肽结构优化。东北农业大学赵鹏昊、尚佳萃、孟祥晨等人按照双肽细菌素结构形成、肽-肽互作及肽-膜互作的逻辑梳理该类抗菌肽发挥抑菌作用的机制，同时综合现有研究阐述双肽细菌素的结构规律及影响其活性的结构要点，以期为双肽细菌素的相关研究提供新的思路。

1、双肽细菌素的模式基序与结构形成

双肽细菌素结构序列中模式基序的存在规律

第一种IIb类细菌素——乳球菌素G于1992年被发现，其特点是两条互补多肽同时存在才能发挥抑菌功效。迄今为止，已经有数十种双肽（IIb类）细菌素被表征，其氨基酸序列中均包含至少一个“GxxxG”基序或“类GxxxG”基序，这些模式基序通常是两端为甘氨酸、中间为3 位随机小取代基氨基酸的五肽序列，当端位甘氨酸被替换为结构相似的丙氨酸或丝氨酸时，被称为“类GxxxG”基序。在由Pls-α和Pls-β组成的植物乳杆菌素S中，破坏Pls-α第5～9位和Pls-β第21～25位类GxxxG基序构建的突变体均保持了活性。类GxxxG基序与GxxxG基序具有相似的特征，这意味着GxxxG基序与类GxxxG基序在结构较为相似的条件下发挥一致的功能，但对于直接影响细菌素活性的模式基序而言，替换基序两端甘氨酸、丝氨酸或丙氨酸都会严重影响细菌素的活性。植物乳杆菌素E/F中的PlnE第5～9位的GxxxG基序，以及PlnF第17～21位、23～27位的类GxxxG基序都属于保守基序。这种结构保守性意味着特定的基序区域可能与活性结构的形成直接相关，微小的结构变化将会影响活性结构的进一步形成。

GxxxG基序与类GxxxG基序端位的氨基酸位点是模式基序最为关键的部分，通过整理部分双肽细菌素结构序列发现，如表1所示，两个模式基序相连时，会共用首/末端甘氨酸，形成GxxxGxxxG结构，多个模式基序相连时同理。此外，GxxxG基序中的3 位随机氨基酸存在一定的规律，出现频率最高的类别是非极性小取代基氨基酸，其中以丙氨酸出现频率最高；其次为芳香族氨基酸和碱性氨基酸赖氨酸。GxxxG基序一般与α-螺旋结构的形成存在密切关系，而当芳香族氨基酸在x位频繁出现时形成的基序与α-螺旋结构无关，而是对应双肽细菌素发挥其他功能。

模式基序对双肽细菌素肽-肽互作的影响

GxxxG基序与类GxxxG基序常见于跨膜结构域，与跨膜结构的α-螺旋形成密切相关，这在双肽细菌素的结构研究中得到了证实。研究表明，在α-螺旋结构中，特征基序两端的小取代基氨基酸（G/S/A）会在螺旋结构中占据同侧位置，使螺旋结构在一侧形成便于彼此靠近的区域，以CbnX、PlnK、Pls-α和PlnF中连续的GxxxG/类GxxxG基序为例（图1），基序端位的氨基酸在多肽的同侧形成了平台区域。这表明根据保守螺旋区域的数量或相互作用的取向，不同来源的双肽细菌素可能存在着多种彼此结合的方式。对乳球菌素G结构的研究表明，LcnG-α的G7xxxG11基序和LcnG-β的G18xxxG22基序在发生互作时，彼此平行取向。根据模式基序的存在位置以及核磁共振波谱（NMR）、圆二色光谱（CD）检测到的螺旋结构，推测植物乳杆菌素E/F是通过PlnE中的 G 5 xxxG 9 或G 20 xxxG 24 基序与PlnF中的G 30 xxxG 34 基序相互作用，通过突变体分析进一步确定PlnE中的G 5 xxxG 9 基序与PlnF中的G 30 xxxG 34 基 序以反向平行的方式发生互作。

基于CD和NMR技术的研究发现，双肽细菌素的任意一条成熟肽在水溶液中通常没有明确结构（图2A），但当其暴露于膜样实体（三氟乙醇、胶束或脂质体）环境，肽链就会出现螺旋结构，而当两条肽链混合后置于膜样实体环境中时，两条肽链的结构又会相互诱导出现进一步的变化（图2B）。

2、双肽细菌素非结构区域的辅助作用

双肽细菌素端位灵活区域的功能

基于定点突变研究提出的乳球菌素G结构模型展示出螺旋结构区域的特点，在该模型中，LcnG-α的阳离子C-末端（R-K-K-K-H）为非结构化的灵活区域。双肽细菌素的结构序列通常是两亲性的氨基酸序列，且在N-末端或C-末端中通常能发现存在阳离子氨基酸，这可能与双肽细菌素以α-螺旋作为跨膜结构域有关。在膜电位的影响下，由两条多肽形成的螺旋-螺旋结构凭借其端位的阳离子区域强制穿过靶细胞膜，从而将细菌素的一端定位在靶细胞内（图2B、C）。

非螺旋特征基序的结构调整作用

通过广泛分析双肽细菌素序列发现，仅通过基序分析无法直接判断肽链是否会参与螺旋-螺旋结构的形成，因为仅有部分GxxxG基序与类GxxxG基序对细菌素活性起到关键作用，高度保守的模式基序也不一定参与跨膜互作。相反，经活性评价分析发现非保守性基序可能与双肽细菌素的功能相关。与GxxxG基序有关的研究已经证明，保守的跨膜结构域基序除了参与螺旋-螺旋互作，还能够调整螺旋的取向、增强螺旋柔性、与脂质互作等（图2A、B）。构成植物乳杆菌素E/F的PlnE由两段分隔的螺旋结构构成，PlnF包含3 个不相连的GxxxG或类GxxxG基序，形成了28 个氨基酸长度的长螺旋结构（S6-H33），类似的结构也存在于片球菌素G、植物乳杆菌素J/K和肉杆菌素X/Y。

双肽细菌素端位芳香残基的定位作用

除了阳离子氨基酸外，芳香族氨基酸也经常出现在细菌素的末端结构中。与LcnG-α肽的C-末端类似，LcnG-β肽的N-末端也拥有多个非结构性的色氨酸序列，这些芳香族氨基酸可能辅助多肽在外膜界面进行定位，使膜外的末端区域稳定在膜外（图2C），从而使螺旋-螺旋位置穿入细胞膜中。在植物乳杆菌素E/F的突变研究中，将PlnE第6位的酪氨酸替换为其他芳香族氨基酸时，细菌素的活性基本得到保留，当替换为精氨酸或亮氨酸后，细菌素活性则显著降低；将PlnF第5位和第14位的两个酪氨酸替换为精氨酸或亮氨酸后，细菌素活性也显著下降，但与PlnE不同的是，即使用其他芳香族氨基酸替换这两个酪氨酸，细菌素的活性仍然会大幅下降，这意味着PlnF中的酪氨酸可能是相对保守的序列位点，其分子结构在空间位置上也具有很强的保守性，或者是酪氨酸的缺失影响了相关氢键的形成，导致无法被其他氨基酸所替代。通常，辅助双肽细菌素穿膜定位的芳香族氨基酸分布在双肽细菌素中靠近端位处，且间距能够满足双肽细菌素螺旋-螺旋结构的穿膜长度。芳香族残基位点的可替换性在一定程度上证明了其残基结构对双肽细菌素穿膜定位的辅助作用，而无法替换的位点也意味着双肽细菌素端位的界面区域是细菌素发挥活性的核心结构，具有一定的保守性。

3、双肽细菌素的肽-膜结合

双肽细菌素的受体

对双肽细菌素受体的探索是该领域近10 年的一个研究热点，膜样实体的存在有助于诱导双肽细菌素的螺旋结构，但并不表示细菌素具有非选择性的跨膜能力。Kjos等首次证明了双肽细菌素依赖于受体的二聚体抗菌肽。双肽细菌素通过与膜样实体相互作用形成成熟的螺旋结构，细菌素完成穿膜过程后在膜表面滑动直至与靶受体相遇（图2C、D）。在随后的两项研究中，研究者又通过抗性突变体全基因组测序的方式，将植物乳杆菌素J/K的可能受体锁定为氨基酸-聚胺-有机阳离子（APC）超家族的一种转运蛋白。转运蛋白包含12 个跨膜螺旋，是大多数APC蛋白成员的核心结构，多个能导致植物乳杆菌J/K抗性增强的单氨基酸突变位点均位于跨膜螺旋10上及螺旋11～12的膜外间区。上述结果表明，跨膜螺旋10～12可能与植物乳杆菌素J/K在结构上直接互作，突变结构导致了细菌素和对接位点之间的相互作用减弱，或原有空间构象扭曲。研究通过比对不同浓度镁离子环境下突变株对细菌素的抗性，验证了转运蛋白CorC是植物乳杆菌E/F的可能靶点。

双肽细菌素对靶细胞的膜渗透结构

现有研究普遍认为，双肽细菌素是通过改变靶细胞膜对小分子的渗透性来达到抑菌效果的，且不同的细菌素带来的靶细胞膜变化并不完全相同。植物乳杆菌素E/F、植物乳杆菌素J/K和乳球菌素G可使靶细胞膜渗透多种单价阳离子（如Na＋、K＋、Li＋、Cs＋、Rb＋）和胆碱，但乳球菌素G不能渗透H＋。这3 种细菌素均不能使靶细胞膜渗透通过二价阳离子（如Mg2＋）或磷酸盐离子（图2E）。

通过比对类片球菌素（IIa类细菌素）的构效关系发现，IIa类细菌素通常包含一个可穿透靶膜的特殊螺旋区域。穿膜螺旋可能是与甘露糖磷酸转移酶系统相互作用的结构基序，虽然α-螺旋结构对于多种双肽细菌素发挥功能具有重要作用，但它并不是双肽细菌素中唯一出现的二级结构，基于单核细胞增生李斯特菌素C的CD和NMR分析结果表明，细菌素中包含大量的β-折叠结构，因为具有显著的序列相似性，嗜热链球菌素13可能也具有相似特性。

膜样实体的存在有助于诱导双肽细菌素螺旋结构，但目前仍然无法确定螺旋结构形成的具体过程。一种方式是脂质与预先结合的双肽结合，从而稳定螺旋-螺旋结构；另一种则是脂质先与单体多肽结合形成稳定的活性单体，再发生多肽间的相互作用。根据现有的跨膜结构域结合脂质的模型推断，双肽细菌素单体肽链端位的正电荷氨基酸与脂质体头部带负电荷的基团相互靠近，减弱排斥作用，促进肽链螺旋结构的稳定和正确定位，随后，细菌素的互补单体多肽分别与脂质结合，脂质诱导两种多肽发生结构重组，促进肽链间螺旋-螺旋相互作用，进而形成脂质-螺旋二聚体的跨膜结构。

结语

根据现有的双肽细菌素研究结果，本文尝试对影响双肽细菌素结构与功能关系的要素进行梳理，双肽细菌素结构需要满足以下几点才能发挥抑菌作用：首先，双肽细菌素是以螺旋-螺旋互作结构作为跨膜结构域的一种二聚体活性蛋白，双肽各单体结构中的α-螺旋通常由GxxxG或类GxxxG基序参与或介导形成；第二，双肽细菌素需要形成一定的灵活区域以调整或稳定肽链螺旋的长度，从而实现基本的穿膜能力；第三，双肽细菌素应至少存在一个包含正电荷氨基酸的端位，便于在接触靶膜的过程中削弱排斥作用，稳定细菌素结构；第四，双肽细菌素端位应包含合适的亲水/疏水基团，在穿膜过程后期辅助二聚体结构在膜上的正确定位。

双肽细菌素发现至今已近30 年，波谱检测技术和固相多肽合成技术的成熟应用推动了双肽细菌的序列分析和结构表征的相关研究，并揭示出新的规律。对双肽细菌素构效关系的深入理解可为双肽细菌素的结构表征和结构优化提供理论支持，也有助于推动双肽细菌素的应用。

本文《双肽（IIb类）细菌素的结构特点及其与功能的关系》来源于《食品科学》2023年44卷09期170-176页.作者：赵鹏昊，尚佳萃，陈禹含，段勃帆，孟祥晨. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220227-235. 点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：彭凯雄 ；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。

图片来源于文章原文及摄图网。

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